I metodi microbiologici rapidi
I metodi microbiologici tradizionali si basano principalmente sulla crescita di microrganismi su terreni di coltura. Questi metodi prevedono la crescita di colonie che si rendono stimabili in 24-48-72 ore dalla semina oppure l’intorbidamento di terreni liquidi, non visibili in genere prima di 5-7 giorni. Questo significa che non è possibile ottenere un risultato prima di 3 giorni per la carica batterica e 5-7 giorni per il controllo di sterilità.
- Funzione dei metodi microbiologici rapidi
I metodi microbiologici rapidi consentono di rilevare la presenza e consentono la quantificazione di microrganismi in tempi brevi per la carica batterica, il test di sterilità, il test dell’efficacia dei batteriostatici, il monitoraggio ambientale in Clean Room, il monitoraggio delle acque di produzione, la ricerca di endotossine.
La rapidità di questi metodi consente ai responsabili di poter prendere decisioni importanti in tempi rapidi per evitare / prevenire inquinamenti che danneggerebbero la produzione o minerebbero la sicurezza e salute dei pazienti utilizzatori.
- I metodi microbiologici rapidi
Le tecnologie che coinvolgono i metodi rapidi si possono così riassumere:
• Amplificazione di acidi nucleici
• Bioluminescenza
• Citometria a flusso
• Colorimetria
• Identificazione fenotipica
• Identificazione genotipica
• Rilevazione della fluorescenza
• Ottica.
- Amplificazione di acidi nucleici
Questi metodi hanno come target il DNA genomico o il DNA ribosomale (rDNA) o l’RNA ribosomale (rRNA).
Si tratta di reazioni a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o non (PCR). E’ stata recentemente sviluppata anche la reazione di amplificazione mediata da trascrizione (TMA) con tecnologia di riduzione del background (BRT).
Sono metodiche molto rapide che richiedono circa 3-8 ore.
Il Milliprobe (Merk-MIllipore) impiega il TMA e BRT.
Risultato in circa 4 ore.
Il MycoSEQ (Life Technologies) si basa su Real Time PCR.
Risultato in circa 4-5 ore.
Il GenDisc (Pall) si basa su Real Time qPCR .
Risultato in circa 7-8 ore.
- Bioluminescenza
La biolumiscenza è un fenomeno che consente ad organismi viventi di emettere luce attraverso reazioni enzimatiche, convertendo l’energia chimica in energia luminosa.
La reazione avviene in presenza di uno specifico enzima (luciferasi), il substrato luciferina, la molecola ATP. L’ATP è presente in tutte le cellule metabolicamente attive, sia di origine procariote che eucariota. E’ la molecola utilizzata dalle cellule per accumulare energia.
Il Pallchek (PALL) consente la determinazione qualitativa e quantitativa di microrganismi vitali e non, in campioni filtrabili o solubilizzabili. I risultati sono espressi in RLU (Relative Light Units).
Il limite di rilevazione è di 1 UFC per campione. Test di sterilità in 48 ore.
Il Milliflex Rapid (Merk-Millipore) ha in linea di massima le stesse prestazioni. I risultati sono espressi in UFC (Unità Formanti Colonie). Il limite di rilevazione è di 1 UFC per volume filtrato.
Il Lumicontrol II (VWR) è un bioluminometro portatile per il monitoraggio dell’igiene delle superfici – risultati in soli 10 secondi – leggero e facile da usare – mantiene in memoria fino a 2000 risultati – funzionamento a batteria (durata 20.000 letture) – interfaccia USB – incluso software per trasferimento dati in excel – dim.: 65x175x32 mm – peso 235 g – completo di sostegno per posizionamento verticale sul banco di lavoro.
- Citometria a flusso
La citometria a flusso è una tecnica che consente la misurazione e la caratterizzazione di cellule vive sospese in mezzo fluido. Queste cellule sono precedentemente marcate con un fluoro-cromo, scelto in base alle caratteristiche fisiche e morfologiche della cellula.
Il BactiFlow ALS (Automated Labeling System) legge la fluorescenza emessa dai microrganismi e/o particelle. La carica batterica si legge in circa 20 minuti ed il test di presenza / assenza in 24 ore.
Il Chemscan RDI (AES) consente il rilevamento diretto di single cellule ed elimina la necessità della crescita e moltiplicazione cellulare. Si ha la marcatura diretta di microrganismi vivi che sono riconosciuti da una scansione laser. I risultati si hanno in circa 3 ore.
- Colorimetria
La colorimetria è applicata alla misurazione della produzione o del consumo di gas. La modifica della composizione gassosa dello spazio di testa viene monitorato in colture chiuse, misurando la produzione di gas (CO2) od il consumo di gas (O2).
Il BioMerieux Bact/Alert si basa sulla presenza di un sensore colorimetrico posto all’interno di un flacone di coltura. Con la crescita batterica si ha un aumento della concentrazione della CO2, con variazione del pH che viene rilevata dal sensore. Il test di sterilità viene ridotto da 14 giorni a 7 giorni.
- Identificazione fenotipica
L’identificazione fenotipica in microbiologia si basa sulla capacità dei singoli microrganismi di utilizzare per la crescita o modificare un substrato biochimico nel quale sono in sospensione a determinate concentrazioni. Ogni classe, famiglia o specie microbica presenta particolari reazioni biochimiche nei confronti di specifici substrati. L’identificazione microbica si ottiene confrontando il profilo di reazione ottenuto per il microrganismo in esame con un profilo standard specie-specifico presente nel database.
Il Biolog Omnilog interpreta le diverse risposte dei microrganismi in relazione alla presenza di fonti energetiche quali azoto e carbonio e produce una identificazione o caratterizzazione.
Il Maldi-Tof con spettrometria di massa determina uno spettro di massa che rappresenta uno “fingerprint” specifico dela specie batterica analizzata. Il raffronto con una data bank consente la identificazione in pochi minuti. I risultati per 30 campioni si ottengono in circa 3 ore.
Il Biomerieux Vitek utilizza “card” per la identificazione biochimica di batteri e lieviti mediante test di acidificazione / utilizzo dei carboidrati e test enzimatici pre-aliquotati in micro pozzetti. I risultati si ottengono in 2-18 ore.
- Identificazione genotipica
La identificazione genotipica si basa sulla determinazione di differenze presenti nel DNA cromosomico od in elementi genetici extra cromosomi ali. La identificazione microbica si raggiunge confrontando il profilo genetico con i profili presenti nel data base.
Il Biomerieux Diversilab esegue la genotipizzazioe automatica tramite REP PCR dei ceppi batterici, funghi e lieviti a partire da colture pure. I risultati si hanno in circa 4 ore.
Il Lifetechnologies Microseq amplifica porzioni del DNA batterico ribosomiale e, previa sequenziazione, le confronta con un data bank. I risultati si hanno in circa 2-6 ore.
Il RiboPrinter Dupont Qualicon effettua la tipizzazione genotipica degli isolati con un processo di ribotipizzazione chiamato “riboprinting”. I risultati si hanno in circa 4-8 ore.
- Rilevazione della fluorescenza
La fluorescenza è la proprietà di assorbire radiazioni elettromagnetiche e di rimetterle nel visibile ad una lunghezza d’onda più elevata.
Il MERCK Millipore Multiflex Quantum consente la numerazione di UFC di batteri, lieviti e muffe in campioni filtrabili. La rilevazione avviene dopo incubazione grazie alla marcatura delle micro colonie presenti sulla membrana. Successivamente si può avere la identificazione dei contaminanti. I risultati si hanno in 24-48 ore.
Il Rapid Micro Biosystem Growth Direct conta le colonie in fase di crescita su terreno nutritivo prima che si evidenzino ad occhio nudo, mediante camera CCD. Successivamente si può avere la identificazione dei contaminanti. Il test di sterilità si esegue in meno di 7 giorni.
- Ottica
Il sistema ottico sfrutta la combinazione con la fluorescenza.
Il IMD-A (Istantaneous Microbial Detector of Air) determina la quantità e la dimensione delle particelle presenti in aria distinguendo quelle “viable” da quelle “non-viable”.
Il sistema AzbilBiovigilant non richiede la coltivazione dei microrganismi.
